Técnicas de Gram: Bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas

Antes da técnica uma pequena orientação...
O que é uma bactéria Gram positiva e bactéria Gram negativa?

É comum em bulas principalmente de antibióticos, observarmos a seguinte frase: “antibiótico indicado para infecções causadas por bactérias Gram-positivas” ou “Gram-negativas”.

Mas afinal o que é isso?

As bactérias de interesse médico apresentam diversas formas: esféricas (cocos), cilíndricas ou bacilos e de espiral. Além disso, de acordo com suas características fenotípicas mais evidentes, elas podem ser subdivididas em cinco grandes grupos. Um desses grupos é o grupo das bactérias que normalmente são coradas pelo método de Gram.

Uma vez que os microorganismos são transparentes, é freqüente o uso de corantes para melhor visualização da forma e do tipo de arranjo. Um dos métodos mais empregados em bacteriologia médica é o método de coloração de Gram.

A coloração de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o médico dinamarquês Hans Christian Joaquim Gram que em 1884 observou de modo empírico que as bactérias adquiriam cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes.

Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas.

Todas as bactérias, sejam Gram-positivas ou Gram-negativas, absorvem de maneira idêntica o cristal violeta e o lugol, adquirindo a cor roxa. Entretanto, ao serem tratadas pelo álcool, apresentam comportamento diferente, isto é, as Gram-positivas não se descoram pelo álcool e as Gram-negativas se descoram facilmente.

Dessa maneira, as bactérias gram-positivas continuam com a cor roxa do complexo cristal violeta/lugol e as Gram-negativas tornam-se descoradas. Ao receber a fucsina, somente as bactérias Gram-negativas se deixam corar e adquirem a cor avermelhada do corante.

É por isso, que quando se examina ao microscópio um esfregaço bacteriano corado pelo método de Gram, as bactérias Gram-positivas se apresentam de cor roxa e as Gram-negativas, de cor avermelhada.

O método de Gram é utilizado na maioria das infecções bacterianas, permitindo o diagnóstico presuntivo de algumas delas com bastante segurança. Estão entre estas as: uretrites gonocócicas, as meningites bacterianas em geral e as infecções urinárias.

A parede celular dos microrganismos gram-positivos é uma estrutura relativamente simples, com espessura de 15 a 50 nm.

A parede celular dos microrganismos gram-negativos é muito mais complexa. A dificuldade em penetrar nesta camada complexa é a razão pela qual alguns antibióticos são menos ativos contra as bactérias gram-negativas.

Geralmente as bactérias "gram negativas" são mais patogênicas, possuindo ainda lipopolissacarídeos na sua membrana exterior, que agravam a infecção.

Alguns microorganismos gram-positivos

Staphylococcus aureus

Lactobacillus sp.

Streptococcus pyogenes

Alguns microorganismos gram-negativos

Pseudomonas aeruginosa

Haemophilus influenzae

Escherichia coli

Helicobacter pylori

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Agora que vc relembrou vamos ver como é feito o procedimento:

1. Confeccionar o esfregaço;
2. Corar com violeta de cristal por 60 segundos;
3. Lavar com esguicho de água destilada;
4. Cubrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos;
5. Lavar com esguicho de água destilada;
6. Descorar com álcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos;
7. Lavar com esguicho de água destilada;
8. Corar com safranina por 60 segundos
9. Lavar com água destilada, secar e observar ao microscópio.

Resultados: Gram (+) coram de roxo, gram (-) coram de vermelho claro ou rosa.

As características estruturais da parede bacteriana estão na base da técnica de Gram que funciona da seguinte forma.

O primeiro corante (cristal-de-metila) penetra na bactéria assim como o mordente (Soluto de Lugol). Intracelularmente forma-se um complexo corante-iodo, insolúvel em água, que vai corar o protoplasma e a parede celular. A camada de peptidoglicano é maior em bactérias gram positivas, as gram negativas, por sua vez possuem pouco peptidoglicano e são coradas pelo vermelho de safranina.

A lavagem com álcool 99,5º GL dissolve o complexo corante-iodo, e a se a parede celular for permeável a este, arrasta-o para fora da célula. As bactérias capazes de preservar a coloração roxa do 1º corante, o violeta de Genciana, designam-se por Gram positivas. As bactérias que, após a lavagem com álcool-acetona, são incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por Gram negativas, corando pela fucsina diluída que se fixa apenas nas bactérias Gram-negativas. Resumindo, as bactérias Gram positivas coram de roxo e as Gram negativas coram de vermelho. Esta técnica de coloração permite então a distinção entre bactérias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactéria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bactéria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída ou danificada (ex. envelhecimento celular ou acção de lisozimas).

Preparação na Coloração:

Na observação microscópica pós coloração o material a observar deve ser previamente fixado, o que facilita a observação de bactérias, uma vez que têm reduzidas dimensões, fraco contraste e algumas refringência e mobilidade.

A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano com o mínimo de deformação e sua colagem à lâmina. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor, o formol e o éter.

A coloração recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura bacteriana. Estes são compostos orgânicos, com um ou mais anéis benzênicos que se encontram ligados a dois grupos funcionais, o cromóforo que é responsável pela cor do corante e o auxócromo que se dissocia ionicamente em solução dotando o corante de capacidade para reagir com os tecidos, células e estruturas celulares. Podemos diferenciar dois tipos de corantes: os corantes ácidos (são negativos, formando sais com cátions) e os corantes básicos (são positivos, formando sais com ânions). Como as bactérias possuem carga eléctrica negativa, existe afinidade entre os corantes básicos e as estruturas celulares da bactéria, permitindo que esta fique corada. Para reforçar a ação do corante, aumentando a força de ligação deste, as estruturas celulares utilizam-se de mordentes como o ácido tânico, o ácido crômico, o ácido fênico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor e os álcalis. Os solutos corantes são compostos de várias substâncias, sendo geralmente hidro-alcoólicos-fenicados porque, além da substância corante, possuem água para permitir a dissociação iônica do corante; álcool para conservar e ácido fênico, que atua como mordente e como bacteriostático, evitando a contaminação das soluções corantes. Após a aplicação do corante, aplica-se um diferenciador, que serve para retirar o excesso de corante (acetona, ácido sulfúrico, álcool 95º). Os diferenciadores têm a capacidade de descorar certas bactérias já previamente coradas e são usados em colorações policromáticas. A preparação de colorações policromáticas segue um protocolo constante. Assim, sobre um esfregaço (células fixadas pelo calor), aplica-se:

1. O primeiro corante
2. O mordente
3. O diferenciador
4. Água (vai parar a diferenciação)
5. Segundo corante (vai ser contrastante)

E-book da Técnica de Coloração de Gram
Ministério da Saúde
Nº de Páginas: 67.
Tamanho: 211 Kb.
Ano: 2001

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